Dosagem em papel-filtro para da alfa-1 antitripsina

Desenvolvimento e validação de um método de imunonefelometria em amostras de sangue em papel-filtro
para a dosagem da alfa-1 antitripsina em pacientes com DPOC*

Validation and development of an immunonephelometric assay for the determination of alpha-1 antitrypsin levels in dried blood spots from patients with COPD

Laura Russo Zillmer, Rodrigo Russo, Beatriz Martins Manzano, Ivan Ivanaga,
Oliver Augusto Nascimento, Altay Alves Lino de Souza, Gildo Santos Júnior,
Francisco Rodriguez, Marc Miravitlles, José Roberto Jardim

Resumo
Objetivo: Validar e desenvolver um método de dosagem de alfa-1 antitripsina (AAT) por imunonefelometria em
amostras de sangue em papel-filtro em pacientes com DPOC no Brasil. Métodos: Amostras de soro e de sangue
em papel-filtro de 192 pacientes com DPOC foram utilizadas para a dosagem de AAT. Para a preparação das
amostras de sangue em papel-filtro, um disco do papel com diâmetro de 6 mm foi colocado em um tubo e eluído
com 200 μL de PBS, permanecendo por toda a noite a 4°C. Todas as amostras foram analisadas em duplicata
por imunonefelometria. O método de reamostragem bootstrap foi utilizado para a determinação de um ponto
de corte para o nível de AAT nas amostras de sangue em papel-filtro. Resultados: O coeficiente de correlação
entre os níveis de AAT em soro e em sangue em papel-filtro foi de r = 0,45. Para as amostras em papel-filtro, o
ponto de corte foi de 2,02 mg/dL (IC97%: 1,45-2,64 mg/dL), com sensibilidade, especificidade, valor preditivo
positivo e valor preditivo negativo de 100%, 95,7%, 27,2% e 100%, respectivamente. Conclusões: Este método
de determinação dos níveis de AAT em sangue em papel-filtro se mostrou uma ferramenta confiável para o
rastreamento de pacientes com deficiência de AAT.
Descritores: Deficiência de alfa 1-antitripsina; Nefelometria e turbidimetria; Doença pulmonar obstrutiva crônica.

Abstract
Objective: To validate and develop an immunonephelometric assay for the determination of alpha-1 antitrypsin
(AAT) levels in dried blood spots from COPD patients in Brazil. Methods: We determined AAT levels in serum
samples and dried blood spots from 192 COPD patients. For the preparation of dried blood spots, a disk (diameter,
6 mm) was placed into a tube, eluted with 200 μL of PBS, and stored overnight at 4°C. All of the samples were
analyzed by immunonephelometry in duplicate. We used the bootstrap resampling method in order to determine
a cut-off point for AAT levels in dried blood spots. Results: The correlation coefficient between the AAT levels
in serum samples and those in dried blood spots was r = 0.45. For dried blood spots, the cut-off value was 2.02
mg/dL (97% CI: 1.45-2.64 mg/dL), with a sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive
value of 100%, 95.7%, 27.2%, and 100%, respectively. Conclusions: This method for the determination of AAT
levels in dried blood spots appears to be a reliable screening tool for patients with AAT deficiency.
Keywords: alpha 1-antitrypsin deficiency; Nephelometry and turbidimetry; Pulmonary disease, chronic obstructive.

* Trabalho realizado no Centro de Reabilitação Pulmonar, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/
EPM – no Departamento de Biologia Molecular, Laboratório Afip; no Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São
Paulo (SP) Brasil; e nos Departamentos de Bioquímica e Pneumologia, Hospital Universitário Vall d’Hebron, Barcelona, Espanha.
Endereço para correspondência: José Roberto Jardim. Rua Botucatu, 740, 3º andar, Pneumologia UNIFESP/EPM, CEP 04021-032,
São Paulo, SP, Brasil.
Tel. 55 11 5572-4301. E-mail: jardimpneumo@gmail.com
Apoio financeiro: Este estudo recebeu apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
Laura R Zillmer foi bolsista de mestrado da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Rodrigo Russo
foi bolsista de doutorado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
Recebido para publicação em 23/7/2013. Aprovado, após revisão, em 19/8/2013.
Zillmer LR, Russo R, Manzano BM, Ivanaga I, Nascimento AO, Souza AAL,
Santos Jr G, Rodriguez F, Miravitlles M, Jardim JR

Introdução
A deficiência de alfa-1 antitripsina (AAT) é
uma alteração genética autossômica codominante,
resultante de mutações no gene SERPINA1
responsável pela síntese da proteína AAT.(1) É
caracterizada por redução dos níveis plasmáticos
da AAT circulante e está associada ao aumento
do risco de enfisema pulmonar precoce,(2) doenças
hepáticas e paniculite.(3)
A deficiência de AAT já foi considerada
uma doença rara; entretanto, segundo dados
epidemiológicos atuais, é uma condição genética
altamente prevalente, mas frequentemente
subdiagnosticada na prática clínica.(3-5)
Estimativas de estudos desenvolvidos em oito
países (Canadá, Holanda, Espanha, Reino Unido,
Itália, Suécia, Nova Zelândia e Austrália) mostram
que apenas 0,41% e 0,35% dos indivíduos
com fenótipo PiZZ e SS, respectivamente, já
tinham sido reconhecidos.(6) No Brasil, não
existem dados epidemiológicos referentes à
prevalência da deficiência de AAT, nem da
frequência dos alelos deficientes.(7)
Recentes recomendações da Organização
Mundial de Saúde, American Thoracic Society
e European Respiratory Society preconizam
a realização de testes quantitativos para a
concentração plasmática de AAT, especialmente
em pacientes com DPOC, doença hepática com
etiologia desconhecida, paniculite necrosante,
bronquiectasia com etiologia desconhecida ou
história familiar de doença hepática, paniculite
necrosante, DPOC e bronquiectasia.(8,9) O diagnóstico
precoce é fundamental para o prognóstico de
pessoas com deficiência de AAT, uma vez que a
história natural do comprometimento pulmonar
é diretamente afetada por fatores ambientais
potencialmente modificáveis, como o tabagismo.(10,11)
O diagnóstico da deficiência de AAT é baseado
na avaliação quantitativa dos níveis séricos de
AAT e na determinação do fenótipo através da
fenotipagem e/ou genotipagem.(12,13) Um dos
problemas para a realização de programas de
triagem refere-se ao manuseio e transporte
do sangue. A implantação da técnica de
sangue em papel-filtro possibilitaria a sua
utilização em programas populacionais, pois
é uma técnica minimamente invasiva, de fácil
armazenamento e que permite o seu transporte
de diferentes regiões para o laboratório central,
sem necessidade de técnicas complexas e de
alto custo para a conservação das amostras.(9,14)
Além disso, essas amostras também podem ser
utilizadas para a realização de fenotipagem
e genotipagem, se necessário.(13,15) A técnica
de sangue em papel-filtro para a dosagem
da AAT ainda não foi desenvolvida no Brasil,
e são poucos os laboratórios que dosam a
sua concentração sérica. Considerando-se a
extensão territorial do Brasil, é importante a
implantação do método de sangue em papelfiltro
no país.
Dessa forma, o presente estudo teve como
objetivo o desenvolvimento e a validação de um
método de dosagem de AAT por imunonefelometria
em amostras de sangue em papel-filtro em
pacientes com DPOC no Brasil.

Métodos
Este foi um estudo transversal que avaliou
pacientes com DPOC recrutados no Ambulatório
de DPOC do Centro de Reabilitação Pulmonar da
Universidade Federal de São Paulo no período
entre julho e setembro de 2011.
Os critérios de inclusão foram os seguintes:
ter diagnóstico de DPOC segundo os critérios da
European Respiratory Society: apresentar VEF1/CVF
em % do previsto após o uso de broncodilatador
menor do que 88% para homens e menor do que
89% para mulheres(16); apresentar estabilidade clínica
nas ultimas seis semanas(17); e ter idade igual ou
superior a 40 anos. Foram excluídos do estudo
pacientes com diagnóstico prévio de deficiência de
AAT com sintomas clínicos de asma ou qualquer
quadro inflamatório ou infeccioso não pulmonar
que elevasse a concentração sérica de AAT.
Todos os pacientes assinaram um termo de
consentimento livre esclarecido. As dosagens de
AAT foram realizadas pelo Centro de Diagnóstico
Brasil, localizado na cidade de São Paulo. A presente
pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e
Pesquisa do Hospital São Paulo/Universidade
Federal de São Paulo, protocolo número 0633/10.
Todos os pacientes incluídos no estudo tinham
realizado espirometria recentemente (há menos
de um ano) utilizando um espirômetro portátil,
da marca Easy One® (NDD Medical Technologies,
Chelmsford, MA, EUA, e Zurique, Suíça). Os valores
de referência para o cálculo do percentual do previsto
basearam-se nos padrões de referência do terceiro
National Health and Nutrition Examination Survey.(18)
Após a avaliação da espirometria e dos critérios de
inclusão e exclusão, os pacientes foram submetidos à
coleta de sangue de duas formas: sangue colhido da
veia cubital em um tubo com EDTA e centrifugado
a 3.200 rpm durante 30 min, sendo o soro separado
e armazenado à −20°C; e gotejamento do sangue
periférico, obtido por uma picadura na região distal
de um dos dedos da mão, sobre um papel-filtro
(Whatman 903, lot W101; Whatman/GE Healthcare,
Florham Park, NJ, EUA); o papel-filtro foi seco
durante 12 h em ar ambiente e então armazenado
à −20°C até o momento da análise.(19)
Para a análise das amostras de sangue em
papel-filtro, os cartões foram perfurados com
um diâmetro de 6 mm, e o círculo foi colocado
em tubos Eppendorf com a adição de 200 μL de
PBS. Essa solução permaneceu a 4°C por 12 h
durante a noite que antecedeu a sua análise. No
dia posterior, os papeis foram retirados da solução
e, subsequentemente, a amostra foi centrifugada
com rotação de 3.200 rpm durante 30 min para
a separação dos resíduos do papel-filtro (parte
sólida) do líquido da amostra, que é denominado
eluato. Quanto ao soro, ele foi descongelado e
centrifugado durante 30 min com rotação de 3.200
rpm. Tanto as amostras do soro quanto as do eluato
foram analisadas em um equipamento Siemens
BNII (Siemens Healthcare, Indianápolis, IN, EUA).
A calibração do equipamento foi realizada
com o soro calibrador padrão SL de proteína N
(Nephelometry; Siemens Healthcare). As curvas de
calibração foram testadas com diferentes diluições
(1:160; 1:80; 1:40; 1:20; 1:10; e 1:5). A margem
de desvio da proteína padrão e o valor obtido
foram aceitos entre uma variação de +5 a −5.
Além disso, foram realizados controles diários com
o padrão SL em diferentes concentrações de AAT:
baixa (101,0 mg/dL); média (159,0 mg/dL); e alta
(231,0 mg/dL).
Para a análise da concentração de AAT, foi
utilizado o reagente antissoro N, que é um soro
animal líquido produzido por imunização de
coelhos com AAT humana altamente purificada
(Siemens Healthcare).
As amostras do eluato e as amostras séricas foram
colocadas em tubos de acrílico de 5 mL para serem
analisadas pelo método de imunonefelometria. Esse
método caracteriza-se pela emissão de um feixe de luz
intenso sobre uma amostra que contém complexos
imunes entre a proteína de AAT e anticorpos
anti-AAT. O feixe de luz, ao entrar em contato
com esse complexo imune, é refletido e captado
por um fotômetro, sendo a intensidade da radiação
refletida proporcional à quantidade de antígenoanticorpo
presente na amostra. Para as amostras
séricas, o equipamento dilui automaticamente as
amostras em 1:20, que é a concentração necessária
para atingir o equilíbrio antígeno-anticorpo no
ensaio. No entanto, as amostras de sangue em
papel-filtro contêm um volume muito menor
de soro, tornando a diluição desnecessária (1:1),
conforme publicações anteriores.(19,20)
A análise estatística foi realizada no programa
Statistical Package for the Social Sciences, versão
18.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA).
As variáveis contínuas foram expressas como média
e desvio-padrão, e as variáveis categóricas foram
expressas como porcentagem. A correlação de
Pearson foi aplicada para determinar a associação
entre duas variáveis paramétricas, a saber, valores
séricos de AAT obtidos em duplicata; valores do
eluato medidos em duplicata; e valores de AAT
sérica em relação aos valores do eluato.
Para a determinação do ponto de corte e do
intervalo de confiança de 97% para as amostras de
sangue em papel-filtro, foi utilizado o método de
reamostragem bootstrap. Esse método consiste na
técnica de reamostragem, pela qual os dados da
amostra real (a amostra do estudo) são sorteados
(com N − 1) para observações, sendo gerados
intervalos de confiança para cada valor calculado.
A amostra é sorteada 1.000 vezes, e são realizados
1.000 modelos para cada uma dessas amostras
N − 1, aumentando o seu poder em casos de
amostras pequenas e melhorando os estimadores
de confiança quando a distribuição da amostra não
é conhecida ou quando a distribuição populacional
não é conhecida. O ponto de corte para as amostras
de sangue em papel-filtro foi também caracterizado
pela sensibilidade, especificidade, valor preditivo
positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN).
Estudo dosagem AAT
Figura 1 – Correlação entre as duas medidas de alfa-1
antitripsina (AAT) sérica (N = 192).
Estudo dosagem AAT2
Figura 2 – Em A, correlação entre as duas medidas de alfa-1 antitripsina (AAT) no eluato de sangue em
papel-filtro (N = 192). Em B, correlação entre as duas medidas de AAT no eluato de sangue em papel-filtro
em amostras sem turbidez (n = 116).
Estudo dosagem AAT3
Figura 3 – Correlação entre as medidas de alfa-1
antitripsina (AAT) sérica e as medidas do eluato de
sangue em papel-filtro (N = 192).

Resultados
Foram contatados 240 pacientes ao longo dos
três meses do estudo. No entanto, somente 192
pacientes preenchiam os critérios de elegibilidade.
Dos 48 indivíduos excluídos, 17 apresentavam
exacerbações, 18 não preencheram os critérios
espirométricos de DPOC, 5 apresentavam resposta
ao broncodilatador e história compatível com asma,
3 apresentavam bronquiectasia, 2 apresentavam
sarcoidose pulmonar, 2 apresentaram câncer pulmonar
e 1 apresentava sequela de tuberculose pulmonar.
Os dados demográficos dos participantes do
estudo estão descritos na Tabela 1. Não houve
diferenças significativas entre os sexos. A média
de idade da população estudada foi de 68,5 ± 9,6
anos. Os indivíduos eram, predominantemente,
da raça branca.
As medidas da espirometria estão descritas na
Tabela 1, e, como esperado para pacientes com
DPOC, os valores da relação VEF1/CVF e de VEF1,
em percentual do valor previsto, caracterizavam
o distúrbio ventilatório obstrutivo.
A quantificação de AAT no soro e no eluato de
sangue em papel-filtro foi realizada em duplicata
para a avaliação da reprodutibilidade da amostra.
A Figura 1 mostra a correlação entre as duas
medidas da AAT sérica (r = 0,98), e a Figura
2A mostra a correlação entre as duas medidas
do eluato de sangue em papel-filtro (r = 0,52).
Algumas amostras de eluato apresentaram
turbidez em uma das duas medidas realizadas,
interferindo no valor obtido de AAT e ocasionando
disparidade entre as duas medidas da mesma
amostra. Por esse motivo, realizamos uma
segunda correlação entre as amostras que não
apresentaram turbidez nas duas medidas do eluato
(n = 116). A segunda análise apresentou uma
correlação de r = 0,84 (Figura 2B). Entretanto,
nenhum dos três pacientes com deficiência
de AAT, conforme as medidas de AAT sérica,
método considerado como o padrão ouro, foi
incluído nessa análise, pois havia turbidez em
uma das amostras da duplicata.
Para a análise da correlação entre a
concentração de AAT sérica e a do eluato de
sangue em papel-filtro, foi selecionado um
dos valores dessa no soro e no eluato que não
apresentasse turbidez. A correlação encontrada
foi de r = 0,45 (Figura 3).
Para a determinação da sensibilidade e
especificidade do método utilizando o eluato, foi
utilizado o método de reamostragem bootstrap,
comparando os valores de medição do soro (padrão
ouro) com os valores encontrados no eluato de
sangue em papel-filtro para a determinação de um
ponto de corte para os valores obtidos no eluato; o
valor encontrado foi de 2,02 mg/dL (IC97%: 1,45-
2,64). Os valores de sensibilidade, especificidade,
VPP e VPN dos valores de eluato de sangue em
papel-filtro estão demonstrados na Tabela 2. Todos
os três pacientes com deficiência de AAT da amostra
apresentavam dosagens de AAT inferiores a 1,80
mg/dL (62,6 mg/dL no soro); os dois valores (2,02
mg/dL e 2,64 mg/dL) apresentaram sensibilidade
e VPN de 100%. Quando utilizamos o ponto de
corte de 2,02 mg/dL, do total de 192 pacientes da
amostra, 14 precisariam realizar o exame no soro
para o diagnóstico dos 3 pacientes com deficiência
de AAT. Entretanto, com o valor de 2,64 mg/dL,
32 pacientes precisariam realizar o exame no soro
para o diagnóstico dos mesmos 3 pacientes.

Tabela 1 – Características demográficas da amostra
(N = 192).a

Características Resultados
Gênero
Feminino 105 (54,7)
Masculino 87 (45,3)
Idade, anosb 65,8 ± 9,6
Etnia
Branca 157 (81,8)
Não branca 35 (18,2)
Espirometriab
VEF1/CVF absoluto 0,47 ± 0,10
VEF1/CVF, % do previsto 62,4 ± 14,4
CVF, L 2,64 ± 0,77
CVF, % do previsto 82,4 ± 19,9
VEF1, L 1,27 ± 0,72
VEF1, % do previsto 51,4 ± 18,9
Tabela 1 – Características demográficas da amostra
(N = 192).a
aValores expressos em n (%), exceto onde indicado. bValores
expressos em média ± dp.

Tabela 2 – Sensibilidade, especificidade e valores
preditivos positivos e negativos em relação a pontos
de corte pelo coeficiente de correlação bootstrap.a
Variáveis Pontos de corte
Obtido Mínimoa Máximoa
2,02 1,45 2,64
Sensibilidade 100,0% 66,6% 100,0%
Especificidade 95,7% 98,9% 86,7%
Valor preditivo
positivo
27,2% 50,0% 10,7%
Valor preditivo
negativo
100,0% 99,4% 100,0%
aEm relação ao IC97%.

Discussão
O objetivo do presente estudo foi desenvolver
e validar a técnica de dosagem da proteína
AAT em eluato de sangue em papel-filtro pelo
método de imunonefelometria em pacientes
com DPOC. Optamos por criar um intervalo de
confiança a partir do ponto de corte definido pela
técnica de reamostragem bootstrap, avaliando
a sensibilidade e a especificidade dos valores
e a sua interferência na escolha clínica para a
triagem de novos pacientes.
O teste quantitativo da AAT sérica é
recomendado para o diagnóstico da deficiência
de AAT.(9) Entretanto, esse teste não é realizado
na grande maioria das cidades brasileiras; o
manuseio, armazenamento, transporte e custos
inviabilizam a sua utilização em larga escala. Em
vista disso, a imunonefelometria de amostras de
sangue em papel-filtro se torna uma atraente
opção para a acessibilidade do teste,(21) já que
o mesmo pode ser enviado pelo correio de
qualquer lugar do Brasil para um laboratório
central.(22) No presente estudo, as amostras
de sangue em papel-filtro foram congeladas
a −20°C, pois elas não foram analisadas logo
após a sua coleta. Porém, as amostras de sangue
em papel-filtro podem ser mantidas em ar
ambiente durante o período de uma semana,
assim como nas temperaturas de 4°C e −20°C
durante quatro semanas.(19)
Os resultados de AAT das amostras séricas em
duplicata foram altamente reprodutíveis (r = 0,98),
mostrando a excelente estabilidade das amostras.
A correlação entre a AAT sérica e a determinada
a partir de amostras de sangue em papel-filtro
foi baixa (r = 0,45), sugerindo que os valores em
amostras de sangue em papel-filtro não podem ser
comparados quantitativamente aos encontrados
no soro. Esse achado difere dos encontrados
por alguns autores, que observaram uma boa
correlação entre a determinação em amostra de
sangue em papel-filtro e a dosagem sérica de AAT.
Wencker et al. realizaram a validação do método
de imunonefelometria em 427 pacientes com
doença pulmonar e encontraram uma correlação
excelente dos valores obtidos em sangue em
papel-filtro e os em soro (r = 0,95), sem nenhum
resultado falso-negativo ou falso-positivo.(22) Esses
resultados corroboram os achados de Costa et
al. em 500 amostras séricas e em sangue em
papel-filtro, que obtiveram uma boa correlação
(r2 = 0,86).(19) Entretanto, os autores salientam
que, apesar de as duas técnicas apresentarem boa
correlação, o uso de sangue em papel-filtro não é
um método quantitativo, mas semiquantitativo,
sendo apropriado para a triagem, baseado em um
ponto de corte, fornecendo resultados positivos ou
negativos para a presença da proteína de AAT. Um
grupo de pesquisadores italianos também validou
o método com o uso de sangue em papel-filtro
comparado com o método padrão no soro em
149 pacientes com concentrações séricas baixas
ou muito baixas de AAT (0,16-0,53 g/L) e em
indivíduos com AAT em níveis intermediários
ou normais (0,54-2,93 g/L). Os coeficientes de
correlação dos dois grupos foram r2 = 0,98 e r2 =
0,90, respectivamente.(20) No entanto, os autores não
avaliaram seus resultados em relação a VPP e VPN
para a avaliação de sensibilidade e especificidade.
O fato de haver uma reconhecida variação
no método de imunonefelometria nos levou a
calcular um intervalo de confiança, obtendo-se
os valores mínimos e máximos em relação ao
valor do ponto de corte. Para a elaboração
desse intervalo, foi utilizado o método de
reamostragem bootstrap, pois a população
de indivíduos portadores da deficiência foi
pequena. Essa análise possibilitou o aumento do
poder amostral, pois ela refez o cálculo 1.000
vezes, encontrando o ponto de corte de 2,02
mg/dL e deixando o IC97% mais preciso (1,45-
2,64 mg/dL). A partir desses resultados, foram
avaliadas a sensibilidade, especificidade, VPP e
VPN do ponto de corte estabelecido por esse
tipo de amostragem (Tabela 2). Para o ponto de
corte de 2,02 mg/dL obtido a partir de amostras
de sangue em papel-filtro, encontramos uma
sensibilidade e uma especificidade de 100% e
95,7%, respectivamente, com VPP e VPN de 27,2%
e 100%, respectivamente. Com a utilização do
valor máximo do intervalo de confiança, é possível
que nenhum paciente com deficiência de AAT seja
identificado como normal. Após uma detalhada
revisão da literatura, não foi encontrado nenhum
estudo que apresentasse valores de intervalo de
confiança para os valores de AAT a partir de
amostras de sangue em papel-filtro.
Para Kwon e Farrell, os testes de rastreamento
devem ser altamente sensíveis, pois essa
característica diminui a probabilidade de um
indivíduo ter um resultado falso-negativo. A
maior preocupação em testes de rastreamento
são os resultados falso-negativos, pois,
provavelmente, o indivíduo será identificado
somente quando apresentar algum sintoma, às
vezes já muito tardiamente, comprometendo o
seu prognóstico.(23) Por outro lado, visando à
detecção de todos os casos com a deficiência,
estabelecendo-se um ponto de corte mais
elevado, ocorrerá um maior número de casos
falso-positivos. A desvantagem dos resultados
falso-positivos na detecção de deficiência de
AAT é evidente, pois mais exames séricos serão
realizados.(24) Entretanto, é importante relembrar
que o rastreamento para novos pacientes com
deficiência de AAT deve começar pela realização
de testes de triagem, e não terminar com eles.
Em relação ao ponto de corte dos valores
obtidos a partir das amostras de sangue em papelfiltro
para a triagem de pacientes com deficiência
de AAT, encontramos na literatura dois estudos
com valores distintos. Um estudo avaliou 300
pacientes com DPOC e 200 indivíduos saudáveis,
e foi observado que todos os pacientes com
deficiência de AAT tinham valores abaixo de
1,8 mg/dL em amostras de sangue em papelfiltro,
que era equivalente a 100 mg/dL na
concentração sérica.(19) Após aquele estudo,
dois grupos de autores adotaram o mesmo
ponto de corte sugerido por Costa et al.,(19)
não encontrando resultados falso-positivos ou
falso-negativos quando comparados a testes
genéticos, mostrando que o valor estabelecido
naquele estudo era altamente preciso.(15,22) Em
2006, Gorrini et al. avaliaram 114 pacientes e
estabeleceram um ponto de corte de 1,13 g/L
para amostras de sangue em papel-filtro, com
sensibilidade e especificidade de 0,92 e 0,90,
respectivamente.(20) Esses valores foram semelhantes
aos demonstrados no presente estudo; entretanto,
o ponto de corte estipulado na presente pesquisa
foi consideravelmente maior, pois decidimos adotar
uma sensibilidade de 100%, diminuindo muito
a possibilidade de resultados falso-negativos.
A imunonefelometria em sangue em papelfiltro
desenvolvida no presente estudo apresentou
uma correlação moderada (r = 0,54) entre os dois
valores da mesma amostra. Entretanto, algumas
amostras apresentaram turbidez em um dos valores
da duplicata, fator que reduz a reflexão da luz no
momento da análise e, consequentemente, reduz
os valores de AAT, o que pode ter interferido
diretamente na correlação da duplicata em sangue
em papel-filtro. Uma subanálise com somente
as amostras que apresentaram os dois valores
da duplicata no eluato sem turbidez apresentou

uma boa correlação (r = 0,84). Nessa subanálise,
nenhum paciente com deficiência de AAT foi
incluído, o que faz com que esse achado possa
não ser representativo para a população de
indivíduos com deficiência de AAT. Nenhum
estudo publicado na literatura comenta sobre
a reprodutibilidade entre as amostras de soro
e de sangue em papel-filtro, tampouco sobre a
interferência da turbidez nas amostras, mas esse
achado sugere que as amostras que apresentarem
turbidez devem ser interpretadas com cautela.
Concluímos que a utilização de amostras de
sangue em papel-filtro é uma excelente alternativa
para a triagem de pacientes com deficiência de
AAT, pois esse método mostrou alta sensibilidade e
especificidade, com baixo VPP e VPN. Entretanto, o
método não pode ser comparado quantitativamente
aos valores séricos de AAT. Cremos ser obrigatória a
escolha do valor superior do intervalo de confiança
para minimizar os diagnósticos falso-negativos.Em
vista disso, o método com o uso de sangue em
papel-filtro é uma atraente solução para a atual
situação de subdiagnóstico da deficiência de AAT
no Brasil, pois permite uma triagem rápida, eficaz,
pouco invasiva e de baixo custo no diagnóstico
dessa deficiência. Novos estudos que investiguem
a prevalência da deficiência de AAT são necessários
para a implantação de programas específicos de
tratamento e manejo dessa condição.

Agradecimentos
Agradecemos ao Laboratório Centro de
Diagnóstico Brasil que nos auxiliou com as dosagens
de AAT. Agradecemos à Associação Brasileira de
Deficientes de Alfa-1 Antitripsina por ter possibilitado
que o Dr. Gildo Santos Júnior fosse para a Itália
para aprender o método da dosagem de AAT em
sangue em papel-filtro com os Drs. Ilaria Ferraroti
e Maurizio Luizetti.

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Sobre os autores
Laura Russo Zillmer
Fisioterapeuta Pesquisadora. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Rodrigo Russo
Médico Pesquisador. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola
Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Beatriz Martins Manzano
Fisioterapeuta Pesquisadora. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Ivan Ivanaga
Fisioterapeuta Pesquisador. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Oliver Augusto Nascimento
Médico Assistente. Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM –
São Paulo (SP) Brasil.
Altay Alves Lino de Souza
Pesquisador. Disciplina de Psicobiologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São
Paulo (SP) Brasil.
Gildo Santos Júnior
Biomédico. Departamento de Biologia Molecular, Laboratório Afip, São Paulo (SP) Brasil.
Francisco Rodriguez
Pesquisador. Departamentos de Bioquímica e Pneumologia, Hospital Universitário Vall d’Hebron, Barcelona, Espanha.
Marc Miravitlles
Pesquisador. Departamentos de Bioquímica e Pneumologia, Hospital Universitário Vall d’Hebron, Barcelona, Espanha.
José Roberto Jardim
Professor Livre-Docente. Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina –
UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.

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