COMO SÃO DESENVOLVIDOS OS NOVOS MEDICAMENTOS?

Wagner Ricardo
30 de agosto de 2015 · São Paulo, SP ·
COMO SÃO DESENVOLVIDOS OS NOVOS MEDICAMENTOS?

Da casca do pau-brasil até o balcão da drogaria

O processo que eu vou descrever simplificadamente é longo, durando entre 10 e 15 anos e custa em média 1,2 bilhões de dólares, de acordo com o Tufts Center for the Study of Drug Development.

Começando do começo, deve haver uma hipótese de que uma molécula ou algo contendo moléculas, como uma planta, possa ter um efeito terapêutico interessante. Esta hipótese pode surgir porque o cientista leu uma série de artigos, ou simplesmente porque alguém apareceu em seu laboratório, com uma casca de uma árvore, digamos, pau-brasil, na mão, dizendo que o chá daquilo cura uma doença X. Vamos continuar com o segundo exemplo, porque é mais divertido.

Se alguém aparecer no meu laboratório com uma casca de árvore dizendo que tem potencial de controle do câncer (por favor, não façam isso), a primeira coisa que eu vou fazer, após ir para os bancos de dados (pubmed) para verificar o que já foi estudado daquela planta, é produzir um extrato daquilo e colocar doses deste extrato sobre culturas de células tumorais.

Vou fazer uma comparação de como se comportam as células tumorais na presença e na ausência do tal extrato e calcular uma série de parâmetros, como velocidade de proliferação, densidade de saturação, capacidade de crescimento em suspensão, alterações morfológicas, bla bla bla. Caso haja um efeito interessante do extrato de pau-brasil sobre as células que eu testei, começa então uma nova fase que é a de fracionar o extrato para saber qual ou quais moléculas dele é que tem este potencial.

Um extrato vegetal apresenta milhares de moléculas diferentes. Eu como cientista, não quero usar um extrato de plantas, porque a única coisa que usar milhares de moléculas juntas vai me fazer é eu ter muitos mais eventos adversos. Uma molécula do pau-brasil produz a inibição de proliferação, enquanto outras nove mil provocam efeitos que não me interessam e podem ser tóxicos. Precisamos então, purificar as moléculas de interesse, mesmo porque você não consegue estudar efetivamente nove mil moléculas misturadas.

Entram nesta fase os químicos e farmacêuticos com seu rico arsenal de métodos de separação e caracterização de moléculas. As várias frações vão sendo testadas, até que depois de anos (sim, leva anos), chegamos à molécula ou ao conjuntinho de moléculas (3 ou 4, sempre poucas), que das nove mil presentes no extrato inicial apresentam o efeito inibidor de crescimento tumoral. Sim, começamos estudando milhares, num trabalho insano, para chegar a UMA, que TALVEZ chegue ao mercado.

Vários testes in vitro são feitos, com diversas linhagens celulares, diversas doses da molécula e começa-se a explorar o mecanismo pelo qual a molécula atua. Não basta saber que inibe proliferação. Queremos saber como, pois se inibir proliferação tanto de células tumorais quanto normais, vai ser bastante tóxico para os indivíduos. Saber como ela atua, detalhadamente permite prever toxicidade e uma série de outros parâmetros. Estes estudos mecanísticos continuam por mais alguns anos e se finalmente o mecanismo for ao menos parcialmente caracterizado, a molécula tiver efeito sobre células tumorais e não for tóxica para células normais, começa-se a pensar no potencial de mercado desta. Caso se observe algum problema de baixa eficácia ou alta toxicidade, é possível ainda nesta fase, que químicos e farmacêuticos alterem a estrutura da molécula para maximizar efeito e minimizar o que é indesejado (mais alguns anos).

Para os cientistas da área básica, fica sempre a impressão de que estamos a um passo do mercado, mas não. Até este momento não usamos nem animais e nem humanos. É nesta fase que eu, Wagner, atuo, há quase duas décadas. Pode-se até usar animal nesta fase para alguma confirmação, mas é em pequeníssima quantidade e nem sempre é necessário e em laboratório deste tipo se usa no máximo rato e camundongo, quando se usa, com total controle e fiscalização dos comitês de ética e quando não há alternativas apenas. Após tudo isso, começam então os estudos pré-clínicos e depois os clínicos, se alguma indústria farmacêutica se interessar pelo que temos até então.

Os estudos clínicos são aqueles feitos em seres humanos. Os pré-clínicos são feitos em animais ou sistemas alternativos. Esta questão de se colocar “priorizar sistemas alternativos”, que encontramos no próprio manual da ANVISA, é mais na esperança de que isso exista e no desencargo de consciência de dizer que não obrigou fazer em animal, do que porque de fato exista para todos os casos. Existem alguns modelos não-animais. Alguns!!! Embora algo possa ser feito em simulador computacional ou tecido, na prática, se você não fizer em animal vai ficar engastalhado com sua pesquisa, porque órgão nenhum vai aprovar que você passe para a fase clínica de testes em humanos se você não fez a fase pré-clínica em animal – entrave legal intransponível. A própria apostila da ANVISA, embora diga que pode ser feito em método alternativo desde que bem descrito, equivalente e internacionalmente aceito, em seguida determina os testes pré-clínicos a serem feitos (toxicidade aguda, toxicidade de doses repetidas, toxicidade reprodutiva, genotoxicidade, tolerância local, carcinogenicidade e toxicocinética) e também quantas espécies devem ser usadas em cada um, se apenas roedor ou uma espécie de roedor e outra de não-roedor. Por lei, convenção ou bom senso, não se pode fazer os estudos clínicos antes dos estudos pré-clínicos.

Como se ve pelos nomes, os testes pré-clínicos, fortemente regulados pela ANVISA, CONCEA, etc são uma exigência legal e servem para nortear dose, via de administração e toxicidade esperada. A partir daí, parte-se para a fase em humanos. Esta fase se subdivide em quatro fases, as chamadas fase I, II, III e IV de Pesquisa Clínica.

Na fase I, utiliza-se um pequeno número de indivíduos e estes são saudáveis na maioria das vezes, a menos que o medicamento em teste tenha grande toxicidade, como quimioterápicos, que já são testados diretamente em indivíduos doentes. A dose é aumentada gradualmente e visa-se estudar segurança e tolerância. Observa-se se o medicamento é absorvido e seu tempo de meia vida (duração) no sangue.

Na fase II, se estuda eficácia e portanto usa-se mais indivíduos portadores da doença que se deseja tratar e se estuda dose e via de administração, em relação à eficácia, ou seja efetividade do tratamento.

Na fase III, o número de indivíduos já passa aos milhares, embora o que defina isso seja a estatística, previamente feita no planejamento do estudo, são doentes e nesta fase o estudo é randomizado e de preferência duplo-cego. Randomizado quer dizer que os indivíduos vão ser divididos em dois grupos aleatoriamente, sem que nada favoreça que um tipo de paciente faça parte mais de um grupo do que de outro. Um grupo receberá a droga nova e outro receberá o tratamento padrão existente e ele é duplo-cego porque nem o paciente e nem o médico sabem quem recebe a droga e quem recebe o tratamento padrão, mas todos os pacientes estão cientes de que fazem parte de um estudo e podem receber um ou outro, e assinam um TCLE (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido). Apenas os coordenadores do estudo sabem quem recebeu o que. Isso é feito para não haver influência psicológica por parte do paciente ou diferença de procedimento em relação à equipe médica, tornando o resultado mais confiável.

Se nesta fase houver benefício demonstrado do tratamento, o medicamento pode ser registrado e comercializado. Após sua entrada no mercado então, após o registro, dá-se a fase IV, onde ocorre a farmacovigilância, que é quando a população que o utiliza vai relatar eventos adversos e benefícios, para que mais conhecimento seja adquirido, já que muito mais indivíduos estão usando e em situações reais.

Antes das décadas de 50-60, o rigor das agências regulatórias não era tão grande, especialmente para os testes pré-clínicos. O que mudou este cenário foi o episódio trágico da talidomida, uma droga então recém-descoberta, que era considerada tão segura que era prescrita para mulheres grávidas, para diminuir o enjôo matinal. A droga foi usada no mundo todo, menos nos EUA, e em 1962 já havia 10 mil casos de focomelia (membros encurtados, como de foca) em bebês nascidos das mães que haviam usado. Foi constatado que os testes de teratogenicidade (malformação fetal) haviam sido feitos apenas em roedores, onde este problema não aparece. Ao se fazer os mesmos testes em coelhos e primatas, viu-se que o problema poderia ter sido evitado, dado que estes não-roedores apresentaram malformação fetal por ação da talidomida.

Por este motivo, as agências regulatórias exigem os testes de teratogenicidade a partir de então em duas espécies, uma sendo de roedores e outra de não-roedores. A situação resultou em uma comoção internacional e fortes críticas à indústria farmacêutica da época, enfatizando a necessidade de melhores testes em animais. O teste de teratogenicidade, por motivos óbvios, é um dos exemplos que não pode ser feito in vitro, em cultura de células, pois não se pode estudar embriogênese, formação fetal, em células isoladas in vitro, e também não pode ser feito diretamente em humanos, pois o risco é muito alto. Toda a noção de teratogenicidade que temos de cada fármaco é proveniente dos ensaios pré-clínicos.

A alegação de que a indústria farmacêutica visa lucro, é verdadeira, assim como o McDonald´s, a pastelaria da esquina e toda e qualquer instituição privada. O benefício dos cientistas com o lucro das industrias farmacêuticas é meramente o fato de que se estas lucram, estas têm capital e estímulo para investir em seus projetos. Cientistas não lucram e todos que conheço têm uma vida bastante modesta.

Cientistas são seres absurdamente sonhadores, entusiasmados, focados, otimistas e cada dia acordamos e vamos para os nossos laboratórios com expectativa de final de copa, acreditando piamente que naquele dia vamos encontrar o resultado revolucionário que vai abrir o caminho para a cura das doenças que estudamos, ou então que vamos dar uma aula show e abrir os olhos e estimular o interesse de nossos alunos para que se encantem pela ciência e continuem o nosso legado. Dormimos tarde porque ficamos no laboratório repetindo aquele experimento só mais uma vez umas cinco vezes, crentes de que vai dar certo, ou lendo só mais um artigo de alguém do outro lado do mundo que fez algo que pode nos ajudar a concluir nossa pesquisa. O que queremos é espaço e possibilidade de colocar nossas ideias em prática. A vasta maioria dos cientistas trabalha em seus laboratórios utilizando sistemas in vitro, nas primeiras fases de desenvolvimento que eu mencionei. Quando a droga de interesse ganha potencial de mercado e passa-se para os testes pré-clínicos, pouquíssimas pessoas e pouquíssimos centros estão envolvidos e isto geralmente ocorre em centros de pesquisa fora das universidades e centros acadêmicos. Eu NUNCA vi um cachorro dentro de nenhum laboratório onde tenha trabalhado. Não é nada comum este tipo de pesquisa na área básica. Ocorrem no pré-clínico, por uma exigência legal e um medo de repetir a tragédia da talidomida da década de 60.

Que a indústria tem que lucrar com os desenvolvimentos, não tenho a menor dúvida, afinal de contas o investimento como dito chega a mais de 1 bilhão de dólares e muitas vezes de um estudo de 10 anos resultam ZERO moléculas comercializáveis, pois no final nenhuma se mostrou adequada.

Da população, para que tenha acesso aos desenvolvimentos deve cuidar o Governo, como diga-se de passagem tem acontecido até que bem, através das farmácias de alto-custo. Não sei como é fora de São Paulo, mas aqui, pelo que eu vejo, todos que necessitam de medicamentos dos mais caros, alguns chegando a muitos milhares de reais por mês, se fizerem a papelada como deve ser, tem esta necessidade atendida satisfatoriamente, através de programas do Governo, claro, quando está previsto o uso daquele medicamento para aquele paciente, seguindo todas as regras pré-estabelecidas.

De dez a quinze anos de estudos, mais de 1 bilhão de dólares, para se chegar a um medicamento e muitas vezes todo este esforço chega a zero medicamentos, fazendo com que a indústria tenha que lucrar com um medicamento de sucesso o fracasso de 3 outras tentativas frustradas. Tenho certeza de que é muito mais trabalhoso e complexo do que você imaginava, pois nem mesmo todos os cientistas têm esta ideia, uma vez que somos muito especializados e trabalhamos exclusivamente em partes deste processo ao longo de nossa carreira.

A minha ideia com este post foi apresentar respostas para perguntas do tipo: Por que não testam em humanos direto? Por que não usam só rato?….e desmistificar a questão do lucro envolvido.

O que a ANVISA exige é que se use roedores e não-roedores. Precisa ser cachorro? Não! Por que em raras ocasiões estes são usados? Porque como já foram muito usados, sabe-se muito sobre eles e é mais fácil interpretar os dados obtidos. Este é um dos motivos. Coelhos também são bastante usados como não-roedores. A domesticabilidade e possibilidade de manutenção em cativeiro em condições adequadas também é levada em consideração. Me agrada a ideia? Claro que não! Acho que vale uma discussão centrada e pautada no bom senso sobre boas práticas e alternativas? Claro que sim!!! Não fosse assim, não estaria explicando coisas estes dias. A Europa e os EUA aboliram o uso de animais no pré-clínico de medicamentos? NÃO!!! A Europa aboliu o teste de cosméticos, o que eu espero seja abolido no mundo todo, pois é uma futilidade desnecessária. Há alternativas para todos os testes? NÃO!!! Gostaríamos que houvesse e trabalhamos no sentido de que haja? SIM!!! Substituímos humanos por animais nos testes? NÃO! Como visto, os humanos também são testados em outra etapa.

Espero que tenha conseguido esclarecer alguns pontos. Gostaria de conseguir escrever menos, mas isso ainda não aprendi. Até o próximo post gigantesco. Abraço a todos!!!​

A ABRADAT apresenta

A ABRADAT apresenta um resumo dos principais pontos da Vigésima Quarta Conferência Nacional Anual de Educação sobre Alfa-1 Antitripsina que ocorreu em Anaheim, Califórnia dos dias 23/07 a 26/07 de 2015.

O que apresentamos abaixo, nos foi passado por uma Portadora de Alfa-1 Antitripsina que compareceu ao evento:

1) A Conferência é organizada pela Alpha-1 Foundation, uma fundação americana não governamental com 20 anos de atividade, cujo objetivo principal é encontrar a cura para a Deficiência de Alfa1 Antitripsina. Ao longo desses 20 anos mais de 56 milhões de dólares foram investidos em pesquisas.

2) A Alpha-1 Foundation também tem como objetivos a educação sobre a condição bem como a advocacia pelos DAAT.

3) O primeiro dia da conferência, dia 23 foi basicamente um dia de boas vidas

4) Uma área com stands de diversos laboratórios, centros de pesquisas, fundações, associações foi montada para que os DAAT e portadores pudessem conversar, saber sobre as últimas novidades e se informar melhor sobre sua condição.

5) As palestras educativas se iniciaram no dia 24, onde tivemos:

5.1) Encontro individuais com os médicos e especialistas em DAAT.

5.2) Mesas redondas com membros da fundação com o objetivo de ajudar no engajamento na causa. As mesas tinham como tema: jovens adultos, pre e pós transplante, como levantar fundos para a causa, dentre outros.

5.3) “The Alpha-1 Project”: para que a fundação pudesse dar ainda mais atenção as pesquisas, foi criada uma nova subsidiária cujo o único objetivo é o financiamento, acompanhamento e colaboração nas pesquisas científicas de novos medicamentos

5.4) Palestra sobre as características básicas da DAAT doença hepática e como cuidar do seu fígado

5.5) Palestra sobre o engajamento dos DAAT em pesquisas científicas.

6) Eventos do sábado, 25 de julho:

6.1) O dia começou com um apanhado geral de tudo o que já foi alcançado nesses 20 anos:

a) 4 drogas para a terapia de reposição de Alfa-1. No Brasil temos aprovado pela Anvisa 3 delas: “Glassia”, “Tripsone” e o “Zaimera”, dos laboratórios: Kamada, Grifols e CSL respectivamente

b)Terapia de reposição de Alfa-1 por inalação em testes clínicos fase 2. Essa terapia está sendo desenvolvida pelo laboratório Kamada

c) Terapia de reposição de Alfa-1 em forma liquida disponível e em testes clínicos

d) Droga para a DAAT doença hepática em testes clínicos

e) Terapia genética em desenvolvimento

6.2) Painel específico sobre a DAAT doença hepática

a) Muitos pontos precisam ser respondidos sobre a DAAT doença hepática, tais como:

Porque somente de 10% a 15% das crianças PiZZ desenvolvem doença hepática?
Porque em algumas crianças com doença hepática parecem melhorar sozinhas enquanto outras precisam de transplante ainda nos primeiros anos de vida?
Quais fatores ambientais e genéticos são determinantes?

b) Uma grande pesquisa está sendo realizada nos EUA com crianças PiZZ para entender os mecanismos do desenvolvimento da doença. “Somente podemos combater o que sabemos como funciona”

c) Consenso geral que todo adulto com DAAT deve ser acompanhado por um hepatologista. ” A DAAT é uma problema no fígado que afeta os pulmões”

d) A terapia em estudo para a DAAT doença hepática chama-se “terapia de silenciamento do gene”. Nesse terapia o fígado pararia de produzir a molécula de Alfa-1 defeituosa, transformando o paciente em PiNull (sem produção alguma de Alfa-1 antitripsina no fígado). O fígado, sendo o órgão com maior capacidade de regeneração, se “curaria” do seu processo cirrótico. Contudo, durante a ingestão da medicação para bloquear a produção de Alfa-1 , teríamos a indicação que ao mesmo tempo o indivíduo utilizasse a terapia de reposição de Alfa-1 (utilizada hoje por aqueles que com DAAT doença pulmonar). Tudo está ainda em fase de estudo, mas já temos um caminho a trilhar.

6.3) Durante o período da tarde, várias pequenas palestras ocorreram ao mesmo tempo com temas diversos, como por exemplo: A Genética da DAAT, Estratégias para aumentar a tolerância nos exercícios, O que conversar com seu médico, vivendo com saúde, dentre outras.

6.4) O domingo dia 26 foi basicamente uma manhã onde rendemos homenagens a aqueles que já não estão mais conosco, mas que participaram da luta pelos DAAT

Acreditamos que a grande mensagem é que não estamos sozinhos. Devemos nos unir para entendermos melhor a nossa condição, sabermos como nos ajudar e ajudar ao próximo.

O 5th Alpha-1 Global Pacient Congress (“Congresso”) aconteceu em Barga, Itália, nos dias 9, 10 e 11 de abril 2015

A Abradat apresenta a seguir uma livre tradução do resumo da 5th Alpha-1 Global Pacient Congress e da 2nd Biennial International Research Conference on Alpha-1 Antitrypsin Deficiency
As fotos do evento podem ser encontradas no seguinte endereço eletrônico:
http://s986.photobucket.com/…/2015%20Alpha-1%20Global%20Pat…
“O 5th Alpha-1 Global Pacient Congress (“Congresso”) aconteceu em Barga, Itália, nos dias 9, 10 e 11 de abril e contou com a participação de 200 pessoas de 26 países . Renomados cientistas, médicos, especialistas, parceiros da indústria, pacientes, cuidadores e familiares estavam reunidos para debaterem sobre o status de:
• Pesquisa científicas
• Quadro regulamentar para o licenciamento de terapias para doenças raras na Europa
• Registros de pacientes
• Formas de reforçar a mensagem da Alfa1 Antitripsina (“AAT”) a nível mundial.
O Congresso foi o primeiro organizado pela Alpha-1 Global (http://www.alpha-1global.org) (“Global”) , um programa da Alpha-1 Foundation (http://www.alpha1.org ) (“Fundação”) dedicado à construção de uma rede colaborativa de organizações de pacientes e suas famílias em todo o mundo. Ele foi lançado como resultado do Congresso de Barcelona, realizado em 2013, onde os participantes decidiram criar uma forma de incentivar a comunicação entre a comunidade de Deficientes de Alfa1 Antitripsina (“DAAT”) ao redor do mundo. Desde então, um site foi criado (http://www.alpha-1global.org) como uma plataforma global para apoiar a comunidade, com ferramentas e conteúdos digitais.
Os congressistas concordaram que a conscientização sobre a AAT ainda é a necessidade mais premente para as suas comunidades em todos os países. A detecção precoce, a advocacia, e acesso tratamentos, especialmente a terapia de reposição, foram as principais prioridades, seguindo-se a necessidade de apoiar um registro internacional de paciente e partilhar recursos úteis dentro da comunidade global.
Para atender a esses objetivos, os participantes concordaram em trabalhar juntos em todo o mundo com o compromisso de dar os próximos passos nesse roadmap : uma estratégia de três anos que inclui trabalhar numa campanha global de conscientização para desenvolver e atender as necessidades da comunidade de Alfa1 ao redor do mundo.
A 2nd Biennial International Research Conference on Alpha-1 Antitrypsin Deficiency (Conferência) foi realizada em conjunto com o Congresso, e teve foco em conceitos inovadores no mecanismos, acompanhamento e tratamento da AAT doença hepática e outras pesquisas sistêmica.
Pesquisadores especializados guiados pelo diretor científico da Fundação Adam Wanner, MD, Giuseppe Lungarella, MD (Universidade de Siena, Itália) e Robert Stockley, MD (Hospital Universitário de Birmingham, Reino Unido), apresentaram pesquisas. Um painel de discussão conjunta entre pacientes e cientistas em 10 de abril apresentou as últimas atualizações sobre a investigação e estimulou ainda mais a interação entre as comunidades científicas e pacientes.
As sessões do Congresso abordaram temas que incluíram:
• Necessidade de melhorar a formação e o suporte para os países no sentido de estabelecer grupos de apoio
• Necessidade de melhorar o suporte para superar as dificuldades enfrentadas no acesso ao tratamento de reposição nos países onde ela ainda não foi aprovada.
Congresso começou na noite de 09 de abril com uma homenagem comovente à memória de duas figuras importantes que vieram a falecer recentemente :
• Maurizio Luisette, MD, de Piva Itália, proeminente pesquisador sobre AAT por suas magnificas conquistas no campo da pesquisa científica
• Mario Ciuffini, anteriormente figura chave na Associação de Pacientes de AAT italiana, por sua significativa contribuição na conscientização sobre AAT
Jonh Wash, presidente da Fundação e membros do Comitê de Direção da Global congratularam-se com os participantes na sexta-feira pela manhã e os atualizaram sobre a situação da comunidade global de pacientes. Dos dados apresentados por Marilyn Black (Austrália e Nova Zelândia), Mimi McPhedran (Canadá), Henry Moehring (EUA), Guillermo Menga (América do Sul), Joanna Chrorostowska (Europa Central) e Catarina Pyrrait (Europa Ocidental) destacaram-se: o sub diagnóstico e falta de consciência sobre AAT. Contudo, também refletiram as medidas já tomadas pelas organizações participantes na construção da comunidade de pacientes e aumento da advocacia em cada uma dessas áreas
Estudos em terapias de novos genes, terapias moleculares e de células-tronco estão no horizonte dos tratamentos de AAT no fígado e no pulmão e foram apresentadas pelos Drs. Jeffrey Teckman, Matthias Griese e Jonathan Edelman. Jonathan Edelman falou sobre as possibilidades futuras para o tratamento da AAT associada a doença hepática. A sessão sobre AAT associada a doença pulmonar foi focada em terapias futuras e na eficácia da inalação e reposição intravenosa de AAT. Teckman é o investigador principal de um estudo multi-center de 5 anos em fígado de DAAT em adultos nos EUA. As inscrições para participar do estudo seguem abertas.
Laura Fregonese , da European Medicines Agency ( EMA) , falou sobre os caminhos científicos e regulamentares para novos tratamentos para doenças raras. Kenneth Chapman, MD, da Canadian Registry; Iliaria Ferrarotti , da Italian Registry; Robert Stockley , da Alpha-1 International Registry ( AR ); e Charlie Strange, diretor da Foundation Research Registry, atualizaram sobre a situação dos registros de pesquisa e sobre a necessidade de colaboração entre paciente, clínico e as comunidades científicas . O tópico , com as suas questões para melhorar a coleta de dados , as questões de proteção de dados através dos países , financiamento e gestão , é considerado essencial na comunidade de DAAT, no sentido de melhorar as oportunidades para a investigação e desenvolvimento de novos tratamentos e para o entendimento da AAT
As sessões no sábado foram focadas em formas de construção de organizações sustentáveis para reforçar a mensagem de Alfa-1 e reforçar a defesa do paciente . Johan Prevot , da International Patient Organization for Primay Immonodeficiencies ( IPOPI ) , e Shane Fitch, da Lovexair Foundation com sede em Espanha , ofereceram diferentes ideias para o desenvolvimento de uma rede de pacientes solida e estratégias de comunicação focadas na sensibilização, detecção e acesso a tratamento.
As sessões de networking enfatizaram os esforços para envolver os adolescentes e adultos jovens e o apoio as crianças DAAT. Esse ponto também foi levantado e discutido na 2014 Alpha-1 National Conference, que ocorreu no Kansas, USA.
Prevot também forneceu exemplos de melhores práticas e orientações em áreas de interesse chave, expandindo uma comunidade internacional de paciente e defendendo os interesses dos pacientes em todo o mundo.
O dia terminou com uma sessão produtiva do trabalho em grupo com representantes de vários países da América Latina, Europa Central, Oceania e América do Norte. O produto da sessão foi estabelecer os próximos objetivos da comunidade global de DAAT. John Wash sumarizou as sugestões da comunidade global, destacando:
• A necessidade de uma campanha global de conscientização
• A partilha de informação para facilitar a criação de novas associações de pacientes nos países.
• Trabalhar no sentido do registro internacional de paciente
• Criar um forte relacionamento entre os médicos e os DAAT no sentido de progredir positivamente em melhores diagnósticos da doença e registros.
A Conferência, que incluiu 17 palestrantes e cerca de 15 debatentes, juntamente com outros participantes, abordou três temas relacionados com a AAT doença pulmonar:
• Mecanismos básicos
• Detecção
• Tratamento.
Wanner resumiu seis novas descobertas científicas apresentadas na Conferência, que, segundo Wanner vai impulsionar pesquisa de AAT e se aproximar de novos tratamentos e, de uma cura:
• Heterozigotos : Alfa-1 portadores – que fumam têm um risco aumentado de perda de função pulmonar em comparação com pessoas sem os genes de Alfa-1 que fumam.
• Alfa1 Antitripsina tem ampla ação anti-inflamatórias e imuno-moduladora em adição para inibir a protease de serina; isto levanta dúvidas sobre o mecanismo pelo qual a terapia de reposição melhora a progressão da doença pulmonar em DAAT, e se a Alfa1 Antitripsina pode ser usada para tratar outras doenças pulmonares, incluindo Fibrose Cística e doença comum pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
• Terapia de reposição, vem sendo agora apresentada em um estudo randomizado, controlado com potência adequada para retardar a destruição do tecido pulmonar, avaliada por densitometria tomografia computadorizada de tórax.
• Terapia de aerossol de Alfa1 Antitripsina é segura e estamos aguardando os resultados de estudos que avaliaram o seu efeito em DAAT com doença pulmonar.
• Dois novos biomarcadores “inteligentes” de deficiência de AAT estão ficando perto de ser totalmente validados como marcadores de presença da doença, progressão e resposta à terapia. Um é o soro desmosina / isodesmosina como um marcador da degradação da elastina (inteligente porque se relaciona mecanicamente ao enfisema), e polímeros de AAT no soro (porque refletem polímeros Z-proteína, que são envolvidos em Alfa1 do fígado e doença pulmonar).
• A terapia genética não está morta. Prova de princípio foi estabelecida com o músculo esquelético como alvo transfecção (viável, mas a baixa eficiência). Outros objetivos, incluindo a pleura (anatomicamente perto do pulmão) estão sob investigação.
Os trabalhos individuais apresentados na Conferência serão publicados em um jornal peer-reviewed a ser anunciado, disse Wanner.”

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2015 Alpha-1 Global Patient Congress by Alpha-1 Foundation

Barga, Italy, April 9-11 -2015

ico_pdf A_Abradat_apresenta_a_seguir_uma_livre_tradução_do_resumo_da_5th_Alpha

Dosagem em papel-filtro para da alfa-1 antitripsina

Desenvolvimento e validação de um método de imunonefelometria em amostras de sangue em papel-filtro
para a dosagem da alfa-1 antitripsina em pacientes com DPOC*

Validation and development of an immunonephelometric assay for the determination of alpha-1 antitrypsin levels in dried blood spots from patients with COPD

Laura Russo Zillmer, Rodrigo Russo, Beatriz Martins Manzano, Ivan Ivanaga,
Oliver Augusto Nascimento, Altay Alves Lino de Souza, Gildo Santos Júnior,
Francisco Rodriguez, Marc Miravitlles, José Roberto Jardim

Resumo
Objetivo: Validar e desenvolver um método de dosagem de alfa-1 antitripsina (AAT) por imunonefelometria em
amostras de sangue em papel-filtro em pacientes com DPOC no Brasil. Métodos: Amostras de soro e de sangue
em papel-filtro de 192 pacientes com DPOC foram utilizadas para a dosagem de AAT. Para a preparação das
amostras de sangue em papel-filtro, um disco do papel com diâmetro de 6 mm foi colocado em um tubo e eluído
com 200 μL de PBS, permanecendo por toda a noite a 4°C. Todas as amostras foram analisadas em duplicata
por imunonefelometria. O método de reamostragem bootstrap foi utilizado para a determinação de um ponto
de corte para o nível de AAT nas amostras de sangue em papel-filtro. Resultados: O coeficiente de correlação
entre os níveis de AAT em soro e em sangue em papel-filtro foi de r = 0,45. Para as amostras em papel-filtro, o
ponto de corte foi de 2,02 mg/dL (IC97%: 1,45-2,64 mg/dL), com sensibilidade, especificidade, valor preditivo
positivo e valor preditivo negativo de 100%, 95,7%, 27,2% e 100%, respectivamente. Conclusões: Este método
de determinação dos níveis de AAT em sangue em papel-filtro se mostrou uma ferramenta confiável para o
rastreamento de pacientes com deficiência de AAT.
Descritores: Deficiência de alfa 1-antitripsina; Nefelometria e turbidimetria; Doença pulmonar obstrutiva crônica.

Abstract
Objective: To validate and develop an immunonephelometric assay for the determination of alpha-1 antitrypsin
(AAT) levels in dried blood spots from COPD patients in Brazil. Methods: We determined AAT levels in serum
samples and dried blood spots from 192 COPD patients. For the preparation of dried blood spots, a disk (diameter,
6 mm) was placed into a tube, eluted with 200 μL of PBS, and stored overnight at 4°C. All of the samples were
analyzed by immunonephelometry in duplicate. We used the bootstrap resampling method in order to determine
a cut-off point for AAT levels in dried blood spots. Results: The correlation coefficient between the AAT levels
in serum samples and those in dried blood spots was r = 0.45. For dried blood spots, the cut-off value was 2.02
mg/dL (97% CI: 1.45-2.64 mg/dL), with a sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive
value of 100%, 95.7%, 27.2%, and 100%, respectively. Conclusions: This method for the determination of AAT
levels in dried blood spots appears to be a reliable screening tool for patients with AAT deficiency.
Keywords: alpha 1-antitrypsin deficiency; Nephelometry and turbidimetry; Pulmonary disease, chronic obstructive.

* Trabalho realizado no Centro de Reabilitação Pulmonar, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/
EPM – no Departamento de Biologia Molecular, Laboratório Afip; no Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São
Paulo (SP) Brasil; e nos Departamentos de Bioquímica e Pneumologia, Hospital Universitário Vall d’Hebron, Barcelona, Espanha.
Endereço para correspondência: José Roberto Jardim. Rua Botucatu, 740, 3º andar, Pneumologia UNIFESP/EPM, CEP 04021-032,
São Paulo, SP, Brasil.
Tel. 55 11 5572-4301. E-mail: jardimpneumo@gmail.com
Apoio financeiro: Este estudo recebeu apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
Laura R Zillmer foi bolsista de mestrado da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Rodrigo Russo
foi bolsista de doutorado da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
Recebido para publicação em 23/7/2013. Aprovado, após revisão, em 19/8/2013.
Zillmer LR, Russo R, Manzano BM, Ivanaga I, Nascimento AO, Souza AAL,
Santos Jr G, Rodriguez F, Miravitlles M, Jardim JR

Introdução
A deficiência de alfa-1 antitripsina (AAT) é
uma alteração genética autossômica codominante,
resultante de mutações no gene SERPINA1
responsável pela síntese da proteína AAT.(1) É
caracterizada por redução dos níveis plasmáticos
da AAT circulante e está associada ao aumento
do risco de enfisema pulmonar precoce,(2) doenças
hepáticas e paniculite.(3)
A deficiência de AAT já foi considerada
uma doença rara; entretanto, segundo dados
epidemiológicos atuais, é uma condição genética
altamente prevalente, mas frequentemente
subdiagnosticada na prática clínica.(3-5)
Estimativas de estudos desenvolvidos em oito
países (Canadá, Holanda, Espanha, Reino Unido,
Itália, Suécia, Nova Zelândia e Austrália) mostram
que apenas 0,41% e 0,35% dos indivíduos
com fenótipo PiZZ e SS, respectivamente, já
tinham sido reconhecidos.(6) No Brasil, não
existem dados epidemiológicos referentes à
prevalência da deficiência de AAT, nem da
frequência dos alelos deficientes.(7)
Recentes recomendações da Organização
Mundial de Saúde, American Thoracic Society
e European Respiratory Society preconizam
a realização de testes quantitativos para a
concentração plasmática de AAT, especialmente
em pacientes com DPOC, doença hepática com
etiologia desconhecida, paniculite necrosante,
bronquiectasia com etiologia desconhecida ou
história familiar de doença hepática, paniculite
necrosante, DPOC e bronquiectasia.(8,9) O diagnóstico
precoce é fundamental para o prognóstico de
pessoas com deficiência de AAT, uma vez que a
história natural do comprometimento pulmonar
é diretamente afetada por fatores ambientais
potencialmente modificáveis, como o tabagismo.(10,11)
O diagnóstico da deficiência de AAT é baseado
na avaliação quantitativa dos níveis séricos de
AAT e na determinação do fenótipo através da
fenotipagem e/ou genotipagem.(12,13) Um dos
problemas para a realização de programas de
triagem refere-se ao manuseio e transporte
do sangue. A implantação da técnica de
sangue em papel-filtro possibilitaria a sua
utilização em programas populacionais, pois
é uma técnica minimamente invasiva, de fácil
armazenamento e que permite o seu transporte
de diferentes regiões para o laboratório central,
sem necessidade de técnicas complexas e de
alto custo para a conservação das amostras.(9,14)
Além disso, essas amostras também podem ser
utilizadas para a realização de fenotipagem
e genotipagem, se necessário.(13,15) A técnica
de sangue em papel-filtro para a dosagem
da AAT ainda não foi desenvolvida no Brasil,
e são poucos os laboratórios que dosam a
sua concentração sérica. Considerando-se a
extensão territorial do Brasil, é importante a
implantação do método de sangue em papelfiltro
no país.
Dessa forma, o presente estudo teve como
objetivo o desenvolvimento e a validação de um
método de dosagem de AAT por imunonefelometria
em amostras de sangue em papel-filtro em
pacientes com DPOC no Brasil.

Métodos
Este foi um estudo transversal que avaliou
pacientes com DPOC recrutados no Ambulatório
de DPOC do Centro de Reabilitação Pulmonar da
Universidade Federal de São Paulo no período
entre julho e setembro de 2011.
Os critérios de inclusão foram os seguintes:
ter diagnóstico de DPOC segundo os critérios da
European Respiratory Society: apresentar VEF1/CVF
em % do previsto após o uso de broncodilatador
menor do que 88% para homens e menor do que
89% para mulheres(16); apresentar estabilidade clínica
nas ultimas seis semanas(17); e ter idade igual ou
superior a 40 anos. Foram excluídos do estudo
pacientes com diagnóstico prévio de deficiência de
AAT com sintomas clínicos de asma ou qualquer
quadro inflamatório ou infeccioso não pulmonar
que elevasse a concentração sérica de AAT.
Todos os pacientes assinaram um termo de
consentimento livre esclarecido. As dosagens de
AAT foram realizadas pelo Centro de Diagnóstico
Brasil, localizado na cidade de São Paulo. A presente
pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e
Pesquisa do Hospital São Paulo/Universidade
Federal de São Paulo, protocolo número 0633/10.
Todos os pacientes incluídos no estudo tinham
realizado espirometria recentemente (há menos
de um ano) utilizando um espirômetro portátil,
da marca Easy One® (NDD Medical Technologies,
Chelmsford, MA, EUA, e Zurique, Suíça). Os valores
de referência para o cálculo do percentual do previsto
basearam-se nos padrões de referência do terceiro
National Health and Nutrition Examination Survey.(18)
Após a avaliação da espirometria e dos critérios de
inclusão e exclusão, os pacientes foram submetidos à
coleta de sangue de duas formas: sangue colhido da
veia cubital em um tubo com EDTA e centrifugado
a 3.200 rpm durante 30 min, sendo o soro separado
e armazenado à −20°C; e gotejamento do sangue
periférico, obtido por uma picadura na região distal
de um dos dedos da mão, sobre um papel-filtro
(Whatman 903, lot W101; Whatman/GE Healthcare,
Florham Park, NJ, EUA); o papel-filtro foi seco
durante 12 h em ar ambiente e então armazenado
à −20°C até o momento da análise.(19)
Para a análise das amostras de sangue em
papel-filtro, os cartões foram perfurados com
um diâmetro de 6 mm, e o círculo foi colocado
em tubos Eppendorf com a adição de 200 μL de
PBS. Essa solução permaneceu a 4°C por 12 h
durante a noite que antecedeu a sua análise. No
dia posterior, os papeis foram retirados da solução
e, subsequentemente, a amostra foi centrifugada
com rotação de 3.200 rpm durante 30 min para
a separação dos resíduos do papel-filtro (parte
sólida) do líquido da amostra, que é denominado
eluato. Quanto ao soro, ele foi descongelado e
centrifugado durante 30 min com rotação de 3.200
rpm. Tanto as amostras do soro quanto as do eluato
foram analisadas em um equipamento Siemens
BNII (Siemens Healthcare, Indianápolis, IN, EUA).
A calibração do equipamento foi realizada
com o soro calibrador padrão SL de proteína N
(Nephelometry; Siemens Healthcare). As curvas de
calibração foram testadas com diferentes diluições
(1:160; 1:80; 1:40; 1:20; 1:10; e 1:5). A margem
de desvio da proteína padrão e o valor obtido
foram aceitos entre uma variação de +5 a −5.
Além disso, foram realizados controles diários com
o padrão SL em diferentes concentrações de AAT:
baixa (101,0 mg/dL); média (159,0 mg/dL); e alta
(231,0 mg/dL).
Para a análise da concentração de AAT, foi
utilizado o reagente antissoro N, que é um soro
animal líquido produzido por imunização de
coelhos com AAT humana altamente purificada
(Siemens Healthcare).
As amostras do eluato e as amostras séricas foram
colocadas em tubos de acrílico de 5 mL para serem
analisadas pelo método de imunonefelometria. Esse
método caracteriza-se pela emissão de um feixe de luz
intenso sobre uma amostra que contém complexos
imunes entre a proteína de AAT e anticorpos
anti-AAT. O feixe de luz, ao entrar em contato
com esse complexo imune, é refletido e captado
por um fotômetro, sendo a intensidade da radiação
refletida proporcional à quantidade de antígenoanticorpo
presente na amostra. Para as amostras
séricas, o equipamento dilui automaticamente as
amostras em 1:20, que é a concentração necessária
para atingir o equilíbrio antígeno-anticorpo no
ensaio. No entanto, as amostras de sangue em
papel-filtro contêm um volume muito menor
de soro, tornando a diluição desnecessária (1:1),
conforme publicações anteriores.(19,20)
A análise estatística foi realizada no programa
Statistical Package for the Social Sciences, versão
18.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA).
As variáveis contínuas foram expressas como média
e desvio-padrão, e as variáveis categóricas foram
expressas como porcentagem. A correlação de
Pearson foi aplicada para determinar a associação
entre duas variáveis paramétricas, a saber, valores
séricos de AAT obtidos em duplicata; valores do
eluato medidos em duplicata; e valores de AAT
sérica em relação aos valores do eluato.
Para a determinação do ponto de corte e do
intervalo de confiança de 97% para as amostras de
sangue em papel-filtro, foi utilizado o método de
reamostragem bootstrap. Esse método consiste na
técnica de reamostragem, pela qual os dados da
amostra real (a amostra do estudo) são sorteados
(com N − 1) para observações, sendo gerados
intervalos de confiança para cada valor calculado.
A amostra é sorteada 1.000 vezes, e são realizados
1.000 modelos para cada uma dessas amostras
N − 1, aumentando o seu poder em casos de
amostras pequenas e melhorando os estimadores
de confiança quando a distribuição da amostra não
é conhecida ou quando a distribuição populacional
não é conhecida. O ponto de corte para as amostras
de sangue em papel-filtro foi também caracterizado
pela sensibilidade, especificidade, valor preditivo
positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN).
Estudo dosagem AAT
Figura 1 – Correlação entre as duas medidas de alfa-1
antitripsina (AAT) sérica (N = 192).
Estudo dosagem AAT2
Figura 2 – Em A, correlação entre as duas medidas de alfa-1 antitripsina (AAT) no eluato de sangue em
papel-filtro (N = 192). Em B, correlação entre as duas medidas de AAT no eluato de sangue em papel-filtro
em amostras sem turbidez (n = 116).
Estudo dosagem AAT3
Figura 3 – Correlação entre as medidas de alfa-1
antitripsina (AAT) sérica e as medidas do eluato de
sangue em papel-filtro (N = 192).

Resultados
Foram contatados 240 pacientes ao longo dos
três meses do estudo. No entanto, somente 192
pacientes preenchiam os critérios de elegibilidade.
Dos 48 indivíduos excluídos, 17 apresentavam
exacerbações, 18 não preencheram os critérios
espirométricos de DPOC, 5 apresentavam resposta
ao broncodilatador e história compatível com asma,
3 apresentavam bronquiectasia, 2 apresentavam
sarcoidose pulmonar, 2 apresentaram câncer pulmonar
e 1 apresentava sequela de tuberculose pulmonar.
Os dados demográficos dos participantes do
estudo estão descritos na Tabela 1. Não houve
diferenças significativas entre os sexos. A média
de idade da população estudada foi de 68,5 ± 9,6
anos. Os indivíduos eram, predominantemente,
da raça branca.
As medidas da espirometria estão descritas na
Tabela 1, e, como esperado para pacientes com
DPOC, os valores da relação VEF1/CVF e de VEF1,
em percentual do valor previsto, caracterizavam
o distúrbio ventilatório obstrutivo.
A quantificação de AAT no soro e no eluato de
sangue em papel-filtro foi realizada em duplicata
para a avaliação da reprodutibilidade da amostra.
A Figura 1 mostra a correlação entre as duas
medidas da AAT sérica (r = 0,98), e a Figura
2A mostra a correlação entre as duas medidas
do eluato de sangue em papel-filtro (r = 0,52).
Algumas amostras de eluato apresentaram
turbidez em uma das duas medidas realizadas,
interferindo no valor obtido de AAT e ocasionando
disparidade entre as duas medidas da mesma
amostra. Por esse motivo, realizamos uma
segunda correlação entre as amostras que não
apresentaram turbidez nas duas medidas do eluato
(n = 116). A segunda análise apresentou uma
correlação de r = 0,84 (Figura 2B). Entretanto,
nenhum dos três pacientes com deficiência
de AAT, conforme as medidas de AAT sérica,
método considerado como o padrão ouro, foi
incluído nessa análise, pois havia turbidez em
uma das amostras da duplicata.
Para a análise da correlação entre a
concentração de AAT sérica e a do eluato de
sangue em papel-filtro, foi selecionado um
dos valores dessa no soro e no eluato que não
apresentasse turbidez. A correlação encontrada
foi de r = 0,45 (Figura 3).
Para a determinação da sensibilidade e
especificidade do método utilizando o eluato, foi
utilizado o método de reamostragem bootstrap,
comparando os valores de medição do soro (padrão
ouro) com os valores encontrados no eluato de
sangue em papel-filtro para a determinação de um
ponto de corte para os valores obtidos no eluato; o
valor encontrado foi de 2,02 mg/dL (IC97%: 1,45-
2,64). Os valores de sensibilidade, especificidade,
VPP e VPN dos valores de eluato de sangue em
papel-filtro estão demonstrados na Tabela 2. Todos
os três pacientes com deficiência de AAT da amostra
apresentavam dosagens de AAT inferiores a 1,80
mg/dL (62,6 mg/dL no soro); os dois valores (2,02
mg/dL e 2,64 mg/dL) apresentaram sensibilidade
e VPN de 100%. Quando utilizamos o ponto de
corte de 2,02 mg/dL, do total de 192 pacientes da
amostra, 14 precisariam realizar o exame no soro
para o diagnóstico dos 3 pacientes com deficiência
de AAT. Entretanto, com o valor de 2,64 mg/dL,
32 pacientes precisariam realizar o exame no soro
para o diagnóstico dos mesmos 3 pacientes.

Tabela 1 – Características demográficas da amostra
(N = 192).a

Características Resultados
Gênero
Feminino 105 (54,7)
Masculino 87 (45,3)
Idade, anosb 65,8 ± 9,6
Etnia
Branca 157 (81,8)
Não branca 35 (18,2)
Espirometriab
VEF1/CVF absoluto 0,47 ± 0,10
VEF1/CVF, % do previsto 62,4 ± 14,4
CVF, L 2,64 ± 0,77
CVF, % do previsto 82,4 ± 19,9
VEF1, L 1,27 ± 0,72
VEF1, % do previsto 51,4 ± 18,9
Tabela 1 – Características demográficas da amostra
(N = 192).a
aValores expressos em n (%), exceto onde indicado. bValores
expressos em média ± dp.

Tabela 2 – Sensibilidade, especificidade e valores
preditivos positivos e negativos em relação a pontos
de corte pelo coeficiente de correlação bootstrap.a
Variáveis Pontos de corte
Obtido Mínimoa Máximoa
2,02 1,45 2,64
Sensibilidade 100,0% 66,6% 100,0%
Especificidade 95,7% 98,9% 86,7%
Valor preditivo
positivo
27,2% 50,0% 10,7%
Valor preditivo
negativo
100,0% 99,4% 100,0%
aEm relação ao IC97%.

Discussão
O objetivo do presente estudo foi desenvolver
e validar a técnica de dosagem da proteína
AAT em eluato de sangue em papel-filtro pelo
método de imunonefelometria em pacientes
com DPOC. Optamos por criar um intervalo de
confiança a partir do ponto de corte definido pela
técnica de reamostragem bootstrap, avaliando
a sensibilidade e a especificidade dos valores
e a sua interferência na escolha clínica para a
triagem de novos pacientes.
O teste quantitativo da AAT sérica é
recomendado para o diagnóstico da deficiência
de AAT.(9) Entretanto, esse teste não é realizado
na grande maioria das cidades brasileiras; o
manuseio, armazenamento, transporte e custos
inviabilizam a sua utilização em larga escala. Em
vista disso, a imunonefelometria de amostras de
sangue em papel-filtro se torna uma atraente
opção para a acessibilidade do teste,(21) já que
o mesmo pode ser enviado pelo correio de
qualquer lugar do Brasil para um laboratório
central.(22) No presente estudo, as amostras
de sangue em papel-filtro foram congeladas
a −20°C, pois elas não foram analisadas logo
após a sua coleta. Porém, as amostras de sangue
em papel-filtro podem ser mantidas em ar
ambiente durante o período de uma semana,
assim como nas temperaturas de 4°C e −20°C
durante quatro semanas.(19)
Os resultados de AAT das amostras séricas em
duplicata foram altamente reprodutíveis (r = 0,98),
mostrando a excelente estabilidade das amostras.
A correlação entre a AAT sérica e a determinada
a partir de amostras de sangue em papel-filtro
foi baixa (r = 0,45), sugerindo que os valores em
amostras de sangue em papel-filtro não podem ser
comparados quantitativamente aos encontrados
no soro. Esse achado difere dos encontrados
por alguns autores, que observaram uma boa
correlação entre a determinação em amostra de
sangue em papel-filtro e a dosagem sérica de AAT.
Wencker et al. realizaram a validação do método
de imunonefelometria em 427 pacientes com
doença pulmonar e encontraram uma correlação
excelente dos valores obtidos em sangue em
papel-filtro e os em soro (r = 0,95), sem nenhum
resultado falso-negativo ou falso-positivo.(22) Esses
resultados corroboram os achados de Costa et
al. em 500 amostras séricas e em sangue em
papel-filtro, que obtiveram uma boa correlação
(r2 = 0,86).(19) Entretanto, os autores salientam
que, apesar de as duas técnicas apresentarem boa
correlação, o uso de sangue em papel-filtro não é
um método quantitativo, mas semiquantitativo,
sendo apropriado para a triagem, baseado em um
ponto de corte, fornecendo resultados positivos ou
negativos para a presença da proteína de AAT. Um
grupo de pesquisadores italianos também validou
o método com o uso de sangue em papel-filtro
comparado com o método padrão no soro em
149 pacientes com concentrações séricas baixas
ou muito baixas de AAT (0,16-0,53 g/L) e em
indivíduos com AAT em níveis intermediários
ou normais (0,54-2,93 g/L). Os coeficientes de
correlação dos dois grupos foram r2 = 0,98 e r2 =
0,90, respectivamente.(20) No entanto, os autores não
avaliaram seus resultados em relação a VPP e VPN
para a avaliação de sensibilidade e especificidade.
O fato de haver uma reconhecida variação
no método de imunonefelometria nos levou a
calcular um intervalo de confiança, obtendo-se
os valores mínimos e máximos em relação ao
valor do ponto de corte. Para a elaboração
desse intervalo, foi utilizado o método de
reamostragem bootstrap, pois a população
de indivíduos portadores da deficiência foi
pequena. Essa análise possibilitou o aumento do
poder amostral, pois ela refez o cálculo 1.000
vezes, encontrando o ponto de corte de 2,02
mg/dL e deixando o IC97% mais preciso (1,45-
2,64 mg/dL). A partir desses resultados, foram
avaliadas a sensibilidade, especificidade, VPP e
VPN do ponto de corte estabelecido por esse
tipo de amostragem (Tabela 2). Para o ponto de
corte de 2,02 mg/dL obtido a partir de amostras
de sangue em papel-filtro, encontramos uma
sensibilidade e uma especificidade de 100% e
95,7%, respectivamente, com VPP e VPN de 27,2%
e 100%, respectivamente. Com a utilização do
valor máximo do intervalo de confiança, é possível
que nenhum paciente com deficiência de AAT seja
identificado como normal. Após uma detalhada
revisão da literatura, não foi encontrado nenhum
estudo que apresentasse valores de intervalo de
confiança para os valores de AAT a partir de
amostras de sangue em papel-filtro.
Para Kwon e Farrell, os testes de rastreamento
devem ser altamente sensíveis, pois essa
característica diminui a probabilidade de um
indivíduo ter um resultado falso-negativo. A
maior preocupação em testes de rastreamento
são os resultados falso-negativos, pois,
provavelmente, o indivíduo será identificado
somente quando apresentar algum sintoma, às
vezes já muito tardiamente, comprometendo o
seu prognóstico.(23) Por outro lado, visando à
detecção de todos os casos com a deficiência,
estabelecendo-se um ponto de corte mais
elevado, ocorrerá um maior número de casos
falso-positivos. A desvantagem dos resultados
falso-positivos na detecção de deficiência de
AAT é evidente, pois mais exames séricos serão
realizados.(24) Entretanto, é importante relembrar
que o rastreamento para novos pacientes com
deficiência de AAT deve começar pela realização
de testes de triagem, e não terminar com eles.
Em relação ao ponto de corte dos valores
obtidos a partir das amostras de sangue em papelfiltro
para a triagem de pacientes com deficiência
de AAT, encontramos na literatura dois estudos
com valores distintos. Um estudo avaliou 300
pacientes com DPOC e 200 indivíduos saudáveis,
e foi observado que todos os pacientes com
deficiência de AAT tinham valores abaixo de
1,8 mg/dL em amostras de sangue em papelfiltro,
que era equivalente a 100 mg/dL na
concentração sérica.(19) Após aquele estudo,
dois grupos de autores adotaram o mesmo
ponto de corte sugerido por Costa et al.,(19)
não encontrando resultados falso-positivos ou
falso-negativos quando comparados a testes
genéticos, mostrando que o valor estabelecido
naquele estudo era altamente preciso.(15,22) Em
2006, Gorrini et al. avaliaram 114 pacientes e
estabeleceram um ponto de corte de 1,13 g/L
para amostras de sangue em papel-filtro, com
sensibilidade e especificidade de 0,92 e 0,90,
respectivamente.(20) Esses valores foram semelhantes
aos demonstrados no presente estudo; entretanto,
o ponto de corte estipulado na presente pesquisa
foi consideravelmente maior, pois decidimos adotar
uma sensibilidade de 100%, diminuindo muito
a possibilidade de resultados falso-negativos.
A imunonefelometria em sangue em papelfiltro
desenvolvida no presente estudo apresentou
uma correlação moderada (r = 0,54) entre os dois
valores da mesma amostra. Entretanto, algumas
amostras apresentaram turbidez em um dos valores
da duplicata, fator que reduz a reflexão da luz no
momento da análise e, consequentemente, reduz
os valores de AAT, o que pode ter interferido
diretamente na correlação da duplicata em sangue
em papel-filtro. Uma subanálise com somente
as amostras que apresentaram os dois valores
da duplicata no eluato sem turbidez apresentou

uma boa correlação (r = 0,84). Nessa subanálise,
nenhum paciente com deficiência de AAT foi
incluído, o que faz com que esse achado possa
não ser representativo para a população de
indivíduos com deficiência de AAT. Nenhum
estudo publicado na literatura comenta sobre
a reprodutibilidade entre as amostras de soro
e de sangue em papel-filtro, tampouco sobre a
interferência da turbidez nas amostras, mas esse
achado sugere que as amostras que apresentarem
turbidez devem ser interpretadas com cautela.
Concluímos que a utilização de amostras de
sangue em papel-filtro é uma excelente alternativa
para a triagem de pacientes com deficiência de
AAT, pois esse método mostrou alta sensibilidade e
especificidade, com baixo VPP e VPN. Entretanto, o
método não pode ser comparado quantitativamente
aos valores séricos de AAT. Cremos ser obrigatória a
escolha do valor superior do intervalo de confiança
para minimizar os diagnósticos falso-negativos.Em
vista disso, o método com o uso de sangue em
papel-filtro é uma atraente solução para a atual
situação de subdiagnóstico da deficiência de AAT
no Brasil, pois permite uma triagem rápida, eficaz,
pouco invasiva e de baixo custo no diagnóstico
dessa deficiência. Novos estudos que investiguem
a prevalência da deficiência de AAT são necessários
para a implantação de programas específicos de
tratamento e manejo dessa condição.

Agradecimentos
Agradecemos ao Laboratório Centro de
Diagnóstico Brasil que nos auxiliou com as dosagens
de AAT. Agradecemos à Associação Brasileira de
Deficientes de Alfa-1 Antitripsina por ter possibilitado
que o Dr. Gildo Santos Júnior fosse para a Itália
para aprender o método da dosagem de AAT em
sangue em papel-filtro com os Drs. Ilaria Ferraroti
e Maurizio Luizetti.

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Sobre os autores
Laura Russo Zillmer
Fisioterapeuta Pesquisadora. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Rodrigo Russo
Médico Pesquisador. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola
Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Beatriz Martins Manzano
Fisioterapeuta Pesquisadora. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Ivan Ivanaga
Fisioterapeuta Pesquisador. Centro de Reabilitação Pulmonar, Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.
Oliver Augusto Nascimento
Médico Assistente. Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM –
São Paulo (SP) Brasil.
Altay Alves Lino de Souza
Pesquisador. Disciplina de Psicobiologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM – São
Paulo (SP) Brasil.
Gildo Santos Júnior
Biomédico. Departamento de Biologia Molecular, Laboratório Afip, São Paulo (SP) Brasil.
Francisco Rodriguez
Pesquisador. Departamentos de Bioquímica e Pneumologia, Hospital Universitário Vall d’Hebron, Barcelona, Espanha.
Marc Miravitlles
Pesquisador. Departamentos de Bioquímica e Pneumologia, Hospital Universitário Vall d’Hebron, Barcelona, Espanha.
José Roberto Jardim
Professor Livre-Docente. Disciplina de Pneumologia, Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina –
UNIFESP/EPM – São Paulo (SP) Brasil.

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